蛋白质免疫印迹法是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来检测特定样品或提取物中某种特定蛋白的方法，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是聚丙烯酰胺凝胶紧贴着膜放置，常用的膜是硝酸纤维素或PVDF（聚偏乙烯氟化物），在电流的作用下蛋白质从凝胶迁移到膜上并且被固定。膜是凝胶蛋白质的复制品，然后可以与抗体结合后进行染色。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开，然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上，利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP标记的二抗结合一抗，再加以ECL发光液显色，检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

                             蛋白免疫印迹法  (科研测试站)

1.新鲜组织，100mg以上（即黄豆大小），干冰运输。

2.细胞量要求为10*10E6及以上，细胞收集方式—— 贴壁细胞：倒掉培养基，pbs清洗2-3次，用细胞刮收集细胞，2000g，离心5min，然后去掉上清液，细胞沉淀干冰运输； 悬浮细胞：2000g，离心5min，然后收集细胞沉淀，干冰运输；

3.血液样本：全血采用EDTA-抗凝管装，至少1ml，4度运输，血清或白细胞采用干冰运输；

4.样本处理时，需避免污染，且需要干冰寄送的样本，请提前自行准备干冰。标本瓶上编号清楚，尽量简易；

需要确定蛋白，提供一抗

1、为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同？

蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲，蛋白质越小，在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响，因此，观察到的实际条带大小可能与预测的不同。

常见的因素包括：

1.翻译后修饰：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质大小。

2.翻译后切割：例如许多蛋白先被合成为前蛋白，然后被切割产生活性形式，例如前半胱天冬酶。

3.剪接变体和异形体：可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。

4.相对电荷-氨基酸（带电和不带电）多聚体组分，例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止，但强相互作用会导致较大的条带出现。

2、蛋白样本为什么要进行还原和变性？

为了使样本被还原和变性，样品缓冲液中会含有十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。SDS是一种变性剂，用来打破蛋白的高级结构，变成初级的氨基酸结构，同时以恒定的质量比包被蛋白质，使其带上负电荷。这一恒定的负电荷比是下一步凝胶电泳分离的关键。β-巯基乙醇和DTT都是还原剂，用来断开蛋白自身的二硫键，进一步使蛋白质变成线性结构，此图中简单地展示了这一过程。顺便提一下，有些抗体只能够识别目标蛋白的天然结构，在这种情况下，样本不需要被还原和变性。所以还原和变性的步骤可以省略。但是，大多数蛋白质印迹分析都需要在还原和变性的体系中进行。

3、为什么检测重组蛋白时难以获得条带？

抗体检测重组蛋白质时，存在难以克服的困难，有必要加以考虑。所以推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。同时，如果重组蛋白带有标签，标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的C或N末端，以降低这种情况发生的可能性（而不是位于蛋白质的阅读框中间）。

4、牛奶和 BSA 封闭有区别？

抗体可能对封闭剂敏感，一般来讲，BSA会产生更清晰的结果，因为BSA含有较少的蛋白，因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此，有些抗体在牛奶中的效果更好，因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白，能封闭更多不同类型的蛋白质。

5.样本只有一部分动物组织，可以冻存后期一起送样吗？

可以的，需要冻存在-80℃。

6.样品是细胞，要求的最低样本量是多少呢？

对于细胞样本，一般要求5*10⁶，离心后能肉眼可见成团细胞沉淀即可。

7.每种类型样品对应的裂解缓冲液？