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原理：将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，用于：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。
DNA pull-down是体外研究DNA与蛋白互作的有力工具，做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合；做质谱鉴定即可筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型。
PULL DOWN (科研测试站)
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1：适配子DNA单链，可以用带有互补链的磁珠进行pull down吗？如果可以，效率怎么样？一般需要怎么优化条件？
理论上说,若DNA单链能够与磁珠上的互补链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条DNA单链是否能杂交成功、蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
2：DNA pull down的 原理？
针对目标区域设计特异性DNA探针并进行生物素标记，生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞蛋白提取物与磁珠-DNA探针孵育，从而钓取与DNA探针有特异性结合的互作蛋白质。
3：对外服务的检测项目有哪些？
细胞、动物/植物组织、菌体都可以做DNA pull down, 我们还可以做的检测实验具体如下:
(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;
(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、双荧光素酶、酵母单杂等;
(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母双杂等;
(4) 细胞学检测：细胞增殖-MTT/CCK-8, 细胞凋亡, 细胞周期,细胞迁移、侵袭：划痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;
(5) 外泌体服务：提取、鉴定(Nanosight粒径检测/电镜/WB)、
测序(miRNA/lncRNA)、蛋白质组学;
(6) 转录组及蛋白质组：真核有参转录组、无参转录组、真核lncRNA、small RNA等。
4：效率有多高？
效率主要取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
5：对照组的DNA序列是怎么选择的？
一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads+蛋白。
6：DNA pull down有什么缺陷吗？
DNA pull down-MS是体外研究蛋白-DNA是否有直接互作的经典技术，是将探针结合在凝胶/磁珠上，钓取与DNA探针有互作的蛋白；就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
7：做DNA pulldown 用DNA单链好还是双链好？
常规的是用DNA双链作为探针。
8：可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗？
主要利用生物素（biotin）和亲和素（avidin）这两种分子的独特性质; 亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的;因此可将其戊suan侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
9：如果做转录因子，转录因子和DNA结合发起转录，不应是和打开的单链结合吗?
启动子是位于转录起始位点（结构基因）5’端上游的DNA序列，就像"开关"，决定基因的活动，本身并不控制基因活动，而是通过与特定蛋白质（转录因子）结合而控制基因的活动。
转录因子就像一面"旗子"，指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活动，这种酶制造着基因的RNA复制本。转录因子是与启动子DNA双链结合的。
10：做100bp突变对照组应该怎么突变碱基？
可以通过查找相关资料确定启动子发挥功能的核心区域,将核心区域进行突变;一般是A/G互换,C/T互换突变。
11：DNA互补链可以相互钓取吗？
DNA pull down 是研究蛋白-DNA的互作,不可以用DNA互补链相互钓取。
12：请问DNA为什么会与蛋白质互作呢，它们有什么功能的联系吗？
DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要应用于寻找已知的启动子序列所结合的未知蛋白（转录因子）；启动子是位于转录起始位点（结构基因）5’端上游的DNA序列，就像"开关"，决定基因的活动，本身并不控制基因活动，而是通过与特定蛋白质（转录因子）结合而控制基因的活动。
13：如果做小肽对细菌的作用是否也可以DNA pull down？
小肽属于蛋白类, 做不了DNA pull down。
14：未加探针的对照组鉴定出蛋白是什么原因呢？
对照组是磁珠beads+蛋白，虽然没有探针，但少量蛋白可以与磁珠相结合，对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白。
15.实验全程如何预防RNA降解？
实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理
16.RNA pull-down一定要体外转录合成RNA探针吗不能基因合成吗？
一般我们认为的基因合成是合成DNA双链，体外转录只是获得RNA的一种方式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验一般是体外转录得到目的RNA。
17.RNA在转录出来后，其OD一般都不高，可以使用吗？咋定量呢？
一般会进行电泳检测（DNA电泳方式一样），可以根据maker浓度来判断RNA的浓度。Pull-down实验不需要精确的定量，都会加入过量的探针。
18.关于样本处理：细胞裂解物裂解的时候要不要加蛋白酶抑制剂还有RNA酶抑制剂这些处理？细胞裂解物提取蛋白是要怎么处理？还是就是裂解细胞就行了？
细胞裂解需要加入蛋白酶和RNA酶抑制剂，通常是反复冻融2-3次即可不需要超声处理。植物组织样品会短时间超声处理。
19.lncRNA引物设计有什么注意事项么？或者说与普通的引物设计有什么区别么？
体外转录扩增的引物只需要在正向引物5端加入T7启动子序列即可。
20.想问下有推荐的银染试剂盒么？
赛默飞或者碧云天都可以。
21.质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选？这个筛选多少分算有效？
pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话一般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。
22.做lncRNA pull down+质谱一般会发现多个互作蛋白对吗？对这多个蛋白，如何选择就哪一种继续研究下去？
不同的RNA结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。
23.lncRNA构建全长序列超表达质粒或者转录序列时，是否需要加polyA序列？以1或者3.0载体为例的话，加了polyA和不加polyA影响大吗？
一般是不需要加入polyA序列，polyA结构的功能与蛋白结合功能无关，反而会增加基因合成的难度。
24.进行功能验证的时候也是不需要加polyA？每个反应需要的细胞量是多少合适？
功能验证构建过表达质粒可以加入polyA；pull-down实验一般要求细胞量至少2*10的7次方。
25.为什么会有假阳性的结果出现？
由于内源性蛋白的干扰，高纯度的GST融合蛋白能够减少实验的假阳性。由于高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性，因此获得高纯度的融合蛋白对于GST-pull down 实验结果 分析具有重要的作用。同时，为了能够最大程度的保证融合蛋白原有的生物学活性，一般在获取融合蛋白时倾向于可溶性融合蛋白，因此获得高纯度的可溶性蛋白很关键。 对于可溶性蛋白的获得条件主要有①载体的选择。②可溶性蛋白表达条件的选择，③诱导温度，④诱导时间，⑤诱导物的浓度，能够不被细胞代谢而且具有稳定的浓度。
(科研测试站)
