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在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。可用于检测如动植物组织、细胞液、全血等样品中目标基因的存在以及相对含量。使用的荧光化学组分一般可分为两种：荧光探针和荧光染料。1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变，如单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
1.请提供已知的全长基因序列和详细背景资料：DNA/RNA来源，丰度；
2.请您提供新鲜的且尽量多的材料，或直接提供纯化好的总RNA或DNA（大于5ug/样本）。
3.动物组织：样本离体应当立即放入液氮或-80℃冰箱中速冻保存，避免反复冻融，并且样本在-80℃的保存时间不宜过长，若保存时间超过半年应及时与工作人员取得联系，组织寄送100mg以上，脂肪组织，结缔组织，纤维化组织适当增加，干冰运输；
4.植物：新鲜的叶、果肉、种子等最少需100mg，干冰运输。
5.细胞：1×10^6个细胞，加入trizol的细胞样本（不要直接运输加trizol的细胞培养皿），Trizol 为裂解液，不适用于组织样本的保存，细胞除外，干冰运输；
6.全血：最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管，4度运输； 血清：最少1 mL，干冰运输；
7.RNA样品： OD260/280为1.8-2.0，浓度≥100 ng/μL，体积≥20μL，干冰运输；cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰运输；
8.送样样本量需至少高于上述提及样本量的三分之一，建议所有样本均做好备份；如果样本特别珍贵，需提前说明。一般情况下，样本不予返还；需要返还的请提前说明，逾期样本将安排清理，样本返回需要客户承担返还费用（包括干冰费和快递费）。
检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2、PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3、PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。
1、引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
4、模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2、反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3、反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
内参基因一般是由物种来确定，在以前的相关研究的参考文献中可以查到。
扩增及溶解曲线：扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映qPCR的动态进程；溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰，如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。
荧光域值（threshold）: 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。
Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。将已知浓度的标准品梯度稀释进行qPCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。
荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期，
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，zui终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入平台期，在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
8.ROX染料是什么作用？
ROX（Passive Reference Dye）是一种惰性参比染料，在qPCR反应中能被qPCR仪检测到。ROX不参与qPCR反应，荧光信号值不会随着qPCR扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异：不均匀的照明，孔与孔之间光学因素（液滴、气泡）的因素，反应体系的浓度不同…… 可以用ROX作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，以提高数据的较精确度。
9.Ct值多少才算理想？
一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是的，需要辅以溶解曲线加以解释。
