GPC凝胶渗透色谱仪原理：凝胶具有化学惰性，它不具有吸附、分配和离子交换作用。让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱（凝胶颗粒）时，较大的分子（体积大于凝胶孔隙）被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多；经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。也叫作体积排阻色谱（SEC）。与液相色谱结构类似，但分离是基于样品分子在溶液中的相对尺寸，是聚合物分析的有力工具。

应用：凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离脂溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于小分子化合物。相对分子质量相近而化学结构不同的物质，不可能通过凝胶渗透色谱法达到完全分离纯化的目的。凝胶色谱不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量相差需在10%以上才能得到分离。可用于小分子物质的分离和鉴定，并可以用来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物（聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开）

a. 常温流动相: 水相、THF、DMF、DMSO、三氯甲烷、六氟异丙醇、a-氯奈；

b. 高温流动相：DMF（80℃），三氯苯；

c. 可以测相对分子量的流动相：水相、THF、DMF、DMSO、三氯甲烷、六氟异丙醇、a-氯奈、三氯苯

d .可以测绝对分子量的流动相：水相、THF、DMF、三氯苯

不同流动相对应的分子量范围：DMF：3000-100万；THF：500-200万；水相：300-50万；氯仿相：500-200万。分子量接近限值的，测试不太准确，低于下限会跟溶剂峰连在一起测不准。

                             GPC凝胶渗透色谱仪

                          GPC工作流程 （科研测试站）

1．样品量：可为液体、粉末、块状样品，粉末样品10mg，液体5-10ml；

2．要求在指定流动相中有较好的溶解性，送样前需要自行确认好样品在指定流动相中的溶解性，难溶样品最好自行溶好再送样, 溶解后的样品要透明均一，过滤头不堵；如果样品溶解性较差，要求提前溶解好（浓度要求在2-5mg /ml左右），或者提供合理溶解方法（如果由实验室溶解，费用问题请提前咨询）

3．样品溶好之后，有机相样品需要过0.45 μm滤膜，水相样品需要过0.22 μm滤膜，样品浓度一般控制在2-5 mg/mL；样品溶好过滤膜后，可能会损失部分样品信息，建议最好送粉末；

4．高温相要保证在该测试温度下样品不分解；并样品不能含F，含F会分解污染柱子

1. 为什么样品要求在指定流动相中溶解性要好？

因为GPC（凝胶渗透色谱）本质上是一个色谱测试，是通过色谱柱分离不同分子量的成分，溶解性不好的话是需要过滤后测试的，不溶成分的分子量就无法测试，而且如果样品溶解度差的话，样品有可能会在色谱柱析出，毁坏柱子

2. 为什么测试结果跟预期分子量差别较大？

第一，gpc的测试原理是每种流动相都有对应的一种标准物质作出的标准曲线，样品测试结果要跟标曲比较，然后得出测试结果，所以大多数流动相得到的结果是样品的相对分子量，如果样品跟标准品差别太大的话，测试结果就有可能跟真实值相差较大；第二，GPC一般测试样品都是聚合物，预期分子量只是基于实验设计的一个预期值，所以有时候跟实际情况有出入也是正常的。

3. 相对分子量和绝对分子量的区别？

第一，测试原理不同：相对分子量时通过建立标准物质的标准曲线，待测样品与之相比得到分子量分布；绝对分子量是通过三联检测器，主要是激光检测器在样品颗粒表面散射角度不同通过数学模型计算分子量分布；第二，检测器不同：相对分子量主要是折光示差检测器，绝对分子量需要示差、粘度、光散射三联检测器；第三，检测分子量范围不同：相对分子量可以检测较小分子量，而一般分子量在几万以上才适合绝对分子量

GPC各个流动相之间有什么差别？

不同流动相对应分子量范围不同：DMF:3000-100万；THF：500-200万；水相300-50万；氯仿500-200万。高温相要保证在该测试温度下样品不分解，目前高温流动相是三氯苯相，是针对高温溶解后降温会析出的样品，如果溶解后降温不析出样品可测常温GPC。

4.样品基质中有大量高分子脂类， SPE小柱分离效果不佳，没有类似SPE小柱那样的凝胶色谱小柱，可以起到分离大分子物质的效果？

理论上液相接上凝胶色谱柱不接检测器可以达到净化效果，把收集到的溶液再浓缩定容即可。目前市面上有一类多功能净化住内含有多重吸附基质，可快速、选择性地吸附样品中的脂类、蛋白质、色素等杂质，且不吸附待测组分，达到快速净化的目的。

5.GPC系统如何平衡？

1)安装色谱柱之前，用两通管连接管路，用流动相替换系统后换上GPC柱子；(注意溶剂互溶情况)

2)RID平衡操作

分析开始前，用流动相冲洗检测器流路。流动相流速1ml/min，切换到RFlow，使流动相通过检测池的样品池和参比池，冲洗20min左右。然后切换RFlow 流路数次，将气泡赶出检测池。关闭RFlow，等待基线平稳。当Balance值高于50，进行Balance调整；

3)色谱柱平衡

等溶剂峰出峰后在经过约一次分析时间后基线才能走平。

6.GPC仪器对载体的要求？

1)良好的化学稳定性和热稳定性；

2)有一定的机械强度；

3)不易变形；

4)流动阻力小；

5)对试样没有吸附作用；

6)分离范围越大越好(取决于孔径分布)等；

7)载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离效率愈高。

7.如何选择合适的GPC柱？

1.根据样品的溶解性质，判断是水相还是有机相，以此选择对应的溶剂类型。尽可能选择色谱柱填充溶剂与样品溶剂相同的色谱柱, 以消除色谱柱溶剂转换的需求，因为溶剂的转换会降低色谱柱的寿命；

2.选择有效分子量范围覆盖样品分子量范围的色谱柱；

3.注意单一孔径柱与混床柱的选择：单一孔径柱用同样孔径的填料装填，更关注于某一特定的分子量范围的柱效；混床柱用不同孔径的填料装填或称为“线性柱”，更关注于用较少的色谱柱到更宽的分子量范围；与混床柱相比，单一孔径柱在特定分子量范围内可以提供更高的分辨率。